納米抗體之噬菌體文庫構(gòu)建過程詳解

　　在羊駝納米抗體制備過程中，除了做好免疫和提取外，噬菌體文庫的構(gòu)建也是其核心過程之一，只有做好了這個(gè)過程，才能獲得我們所需的抗體庫。那么，在提取淋巴細(xì)胞之后，如何構(gòu)建噬菌體文庫呢?今天普健生物就在這里和大家一一介紹。

　　對于不同的公司來說，納米抗體噬菌體文庫的構(gòu)建是各不相同的，不過主要的區(qū)別在一些細(xì)節(jié)流程方面，大體的制備過程如下：

　　1、提取RNA。將我們提取的淋巴細(xì)胞溶解后轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入氯仿后混勻，離心15分鐘后轉(zhuǎn)至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，靜置10分鐘后再次離心10分鐘后，用75%的乙醇清晰沉淀，離心5分鐘后去除上清液，而后將其溶解質(zhì)無RNA酶的水中;

　　2、轉(zhuǎn)錄cRNA。將如上所得RNA一分為二，轉(zhuǎn)錄成cDNA;

　　3、擴(kuò)增。將轉(zhuǎn)錄出的cDNA擴(kuò)增到特定的抗體片段中;

　　4、克隆至噬菌體。將擴(kuò)增所得的多樣化抗體基因序列和噬菌體進(jìn)行酶切，通過純化后進(jìn)行鏈接反應(yīng)。而后再將所得DNA純化后回收，并使用超純水進(jìn)行溶解;

　　5、擴(kuò)增和純化。將如上所得的噬菌體鏈接物進(jìn)行培養(yǎng)，按照輔助噬菌體數(shù)目20:1的比例加入輔助噬菌體后繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘，加入濃度50ug/ml的卡那霉素，30度下?lián)u床培養(yǎng)。所得培養(yǎng)的菌體離心5分鐘后提取上清液，冰敷30分鐘后離心10分鐘并去除緩沖物中的溶解沉淀。再加入nacl后，冰上孵育10分鐘后離心15分鐘，最終得到噬菌體庫;

　　納米抗體噬菌體文庫構(gòu)建的一些注意事項(xiàng)：

　　1、噬菌體文庫容量和多樣性是衡量文庫優(yōu)質(zhì)與否的重要因素，一般來說，容量越大、多樣性越好，構(gòu)建的噬菌體文庫質(zhì)量越佳;

　　2、在RNA提取的過程中，RNA的降解和反轉(zhuǎn)錄過程中模板、引物及其用量，擴(kuò)增輪數(shù)、細(xì)菌轉(zhuǎn)化效率、連接體大小等因素我們都需要多注意一下;

　　總的來說，噬菌體文庫構(gòu)建成功與否，提取和擴(kuò)增過程都是非常重要的，如果這幾步的操作不成功的話，會在極大程度上影響到抗體制備的成功與否。所以，對于我們來說，只有做好這幾個(gè)方面的工作，才能在更大程度上促進(jìn)實(shí)驗(yàn)的完成。普健生物專業(yè)為廣大用戶提供噬菌體文庫構(gòu)建服務(wù)，如果您有相關(guān)需求，歡迎來電咨詢。